Практические аспекты автоматического секвенирования

Первый вопрос, требующий прояснения — как быть с синтезом праймера, если начало секвенируемого фрагмента ДНК неизвестно. Ответа может быть два. Первый (тривиальный) — каким-то другим способом определить начальную последовательность секвенируемой ДНК. Второй — присоединить к этой ДНК, перед ее началом, с помощью естественной сахаро-фосфатной связи другую короткую, но хорошо известную последовательность нуклео-тидов. Синтезировать праймер по ней, на нее же его посадить и таким образом заставить ДНК-полимеразу считывать интересующую нас матрицу с первого нуклеотида. Оба варианта решения проблемы можно найти в уже знакомом нам материале:

1. Выяснение начальной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК

а) Если о нем ничего неизвестно, то можно воспользоваться «устаревшим» методом Максама и Гилберта, который для первых десятков нуклеотидов достаточно быстро дает вполне надежные сведения.

б) В случае, если нас интересует секвенирование определенного гена, направляющего биосинтез вполне конкретного белка известной структуры, и если есть основание полагать, что этот ген (или хотя бы его начало) входит в состав обследуемого фрагмента ДНК. А значит и такой же длины начальную последовательность дезоксирибонуклеотидов соответствующего гена. Синтезированный праймер в этом случае просто воспроизведет расшифрованную часть иРНК.