Результаты исследований

Приложение 4. Инструкция по применению набора иммунофлюоресцентного для выявления возбудителя болезни Лайма в переносчиках

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГУ «НИИ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ»

220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23, тел. 226-56-75

УТВЕРЖДЕНА МЗ РБ

26 июня 2003 г.

№ гос. рег. МН-7.3519-0204

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

набора иммунофлюоресцентного для выявления

возбудителя болезни Лайма в переносчиках

Набор представляет собой комплект, основным компонентом которого является иммунная сыворотка, содержащая антитела к возбудителю болезни Лайма (БЛ).

Основное свойство набора – способность выявлять возбудителя БЛ в переносчиках за счёт специфического взаимодействия антител иммунной сыворотки с антигеном возбудителя. Комплекс антиген-антитело выявляют с помощью антивидовой сыворотки, меченой флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ), дающей чётко выраженное изумрудно-зелёное свечение микробных клеток возбудителя при люминисцентном микроскопировании. Все компоненты набора являются неинфекционными.

1. НАЗНАЧЕНИЕ

Набор предназначен для выявления антигена – возбудителя БЛ (Borrelia burgdorferi sensu lato) в переносчиках методом, базирующемся на реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

Основными переносчиками возбудителя Лайм-боррелиоза являются иксодовые клещи - I. ricinus, реже боррелии обнаруживаются в клещах D. reticulatus. Могут быть исследованы случайные переносчики – другие кровососущие членистоногие приподозрении на вероятность наличия у них возбудителя БЛ.

Исследованию подлежат живые особи любой стадии развития (голодные и напитавшиеся), а также погибшие (без признаков плесени), высохшие переносчики (после их размачивания в цитратно-фосфатном буферном растворе (ЦФБ) при 4-6°С в течение 12-24 часов). Могут быть исследованы фрагменты клеща (часть брюшка).

2. СОСТАВ НАБОРА

2.1. Иммунная сыворотка, готова к использованию, 1,5 мл – 1 пр-ка

2.2. (К+)-антиген возбудит. БЛ, готов к использов., 0,2 мл – 1 пр-ка

2.3. Конъюгат, готов к использованию, 1,5 мл – 1 пр-ка

2.4. Концентрат ЦФБ, 25х, 20 мл – 4 фл.

2.5. Предметные стёкла с лунками, – 3 шт.

2.6. Предметные стёкла без лунок, – 1 шт.

3. ПРИГОТОВЛЕНИ ЦФБ, РАЗЛИВ И ХРАНЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ

3.1. Приготовление ЦФБ (цитратно-фосфатного буферного раствора), рН 7,2-7,4: содержимое 1 флакона (п. 2.4.) разводят дистиллированной водой до объёма 500 мл. (Если во флаконе с концентратом ЦФБ образовались кристаллы солей, их предварительно растворяют, помещая флакон в тёплую воду.) проверяют и в случае необходимости коррегируют рН. Применяется для приготовления суспензий из переносчиков, отмывки предметных стёкол. Хранение при 4-6°С до 1 недели.

3.2. Иммунную сыворотку (п.2.1.) разливают на несколько порций из расчёта 10 мкл (0.01 мл) на лунку и хранят до использования при -20°С. Размороженный реагент может храниться при 4-6°С в течение 72 часов.

3.3. К+ (п. 2.2.) разливают порциями по 20 мкл (0.02 мл) и хранят до использования при -20°С. Размороженный реагент может храниться при 4-6°С в течение 72 часов.

3.4. Конъюгат (антивидовые иммуноглобулины, меченые ФИТЦ) с раствором Эванса голубого (п. 2.3.) разливают на несколько порций из расчёта 10 мкл (0,01 мл) на лунку и хранят до использования при -20°С. Размороженный реагент может храниться при 4-6°С 72 часа.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕРЕНОСЧИКОВ

4.1. Подготовка к исследованию.

4.1.1. Чистые предметные стёкла с лунками и без лунок ополаскиваются дистиллированной водой и досуха протирают марлевой салфеткой.

4.1.2. Иммунную сыворотку (п.2.1.), К+ (п. 2.2.) и конъюгат (п. 2.3.) размораживают при комнатной температуре. Готовы к применению.

4.1.3. На предметное стекло без лунок наносится капля ЦФБ объёмом 10-20 мкл (0,01- 0,02 мл) в зависимости от размера переносчика. При исследовании сильно напитавшихся самок клещей объём капли может быть увеличен до 50 мкл (0,05 мл). исследуемого членистоногого помещают в каплю брюшком кверху и0, придерживая глазным пинцетом, либо другим инструментом, иссекают его тело препаровальной иглой.

4.2. Постановка РНИФ.

4.2.1. В лунку предметного стекла переносят жидкую фракцию приготовленной суспензии (10-20 мкл), не допуская попадания крупных частиц.

4.2.2. В одну или две свободные лунки предметного стекла вносят по 10 мкл (0,01 мл) антигена возбудителя БЛ (К+).

4.2.3. препарат высушивают при комнатной температуре или в термостате (при 37°С), ополаскивают дистиллированной водой и снова высушивают.

4.2.4. Затем во все лунки вносят по 10 мкл (0,01 мл) иммунной сыворотки. инкубируют во влажной камере при 37°С 30 минут.

4.2.5. По окончанию инкубации стекло ополаскивают дистиллированной водой и отмывают в ЦФБ в течение 15 минут на магнитной мешалке или вручную, снова ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.